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PCR: Ablauf, Primer und Auswertung einfach erklärt
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt einen ausgewählten DNA-Abschnitt außerhalb einer Zelle. Dazu wechseln drei Temperaturphasen immer wieder: Die DNA-Stränge trennen sich, passende Primer binden und eine hitzestabile Polymerase ergänzt neue Stränge.
Hake ab, was du schon kannst — und komm am Ende hierher zurück!
Was braucht eine PCR?
Stell dir vor, in einer Probe ist so wenig von einem bestimmten DNA-Abschnitt enthalten, dass er sich kaum untersuchen lässt. Die PCR erzeugt davon viele Kopien. Gezielt ist sie, weil zwei passende Primer Anfang und Ende des zu kopierenden Bereichs festlegen.
PCR
PCR steht für polymerase chain reaction, auf Deutsch Polymerase-Kettenreaktion. Es ist ein enzymatisches In-vitro-Verfahren: Ein ausgewählter DNA-Abschnitt wird außerhalb eines Organismus in einem Reaktionsgefäß vervielfältigt.
Für die Reaktion werden benötigt:
- die DNA-Probe mit dem gesuchten Zielabschnitt als Vorlage;
- zwei unterschiedliche, zum Ziel passende Primer als Startpunkte;
- freie Nukleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin als Bausteine;
- eine hitzestabile DNA-Polymerase, häufig Taq-Polymerase;
- Puffer und Magnesium-Ionen für geeignete Reaktionsbedingungen;
- ein Thermocycler, der die Temperaturen automatisch wechselt.
Die Taq-Polymerase stammt ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Ihre Hitzestabilität ist entscheidend, weil die Reaktion wiederholt stark erhitzt wird.
Wie läuft ein PCR-Zyklus ab?
Ein Zyklus besteht immer aus drei Schritten. Die genauen Temperaturen hängen unter anderem von den Primern und der verwendeten Polymerase ab; typische Bereiche sind:
- Denaturierung bei etwa 94–96 °C: Die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen lösen sich. Aus dem DNA-Doppelstrang werden zwei Einzelstränge.
- Primerhybridisierung bei etwa 50–65 °C: Beim Abkühlen binden die Primer durch komplementäre Basenpaarung an ihre passenden Stellen. Dieser Schritt heißt auch Annealing.
- Elongation bei etwa 68–72 °C: Die DNA-Polymerase verlängert die gebundenen Primer. Sie fügt am 3′-Ende passende Nukleotide an; der neue Strang wächst in 5′→3′-Richtung.
Zu Beginn liegt ein DNA-Doppelstrang mit dem Zielabschnitt vor. Nach dem Erhitzen sind seine Einzelstränge getrennt. Beim Abkühlen bindet an jeden Vorlagenstrang ein passender Primer. Die Taq-Polymerase ergänzt von diesen Startpunkten aus die jeweils komplementären Stränge. Im idealisierten Fall liegen danach zwei DNA-Doppelstränge vor, die im nächsten Zyklus wieder als Vorlagen dienen.
Trennen – Andocken – Verlängern: hohe Temperatur trennt die Stränge, niedrigere Temperatur ermöglicht die Primerbindung, und die Arbeitstemperatur der Polymerase ermöglicht die Synthese.
Wähle in jeder Lücke die passende Form und prüfe anschließend deine Antworten.
Bei der werden die DNA-Stränge getrennt. Danach binden bei der die Primer. In der ergänzt die Polymerase neue DNA-Stränge.
Warum bestimmen Primer das Produkt?
Ein Primer ist ein kurzer, künstlich hergestellter DNA-Einzelstrang. Seine Basenfolge muss komplementär zu einer Bindestelle der Vorlage sein. Weil die beiden Vorlagenstränge unterschiedlich orientiert sind, braucht die PCR zwei verschiedene Primer.
Die Polymerase kann nicht an einer beliebigen Stelle neu beginnen. Sie verlängert nur einen bereits gebundenen Primer an dessen 3′-Ende. Die Primer zeigen dabei auf den Bereich, der zwischen ihnen kopiert werden soll.
Soll nur Abschnitt B aus einer längeren DNA mit den Bereichen A–B–C vervielfältigt werden, wird ein Primer vor B und der zweite auf dem Gegenstrang hinter B gewählt. Binden beide passend, entsteht in den folgenden Zyklen überwiegend DNA mit den durch diese Bindestellen festgelegten Grenzen. Ein Primerpaar für andere Bindestellen würde ein anderes Produkt erzeugen.
Für einen gezielten Primerentwurf müssen die Sequenzen an den Grenzen des gewünschten Abschnitts bekannt sein. Unpassende Bindebedingungen oder ungeeignete Primer können dazu führen, dass kein Produkt oder zusätzliches, unerwünschtes Produkt entsteht.
Wie wächst die DNA-Menge?
Die Produkte eines Zyklus werden im nächsten Zyklus selbst zu Vorlagen. Verdoppelt sich jedes passende DNA-Molekül in jedem Zyklus, gilt im idealisierten Modell bei einem Ausgangsmolekül:
$$N = 2^n$$
Dabei ist $n$ die Zahl der Zyklen und $N$ die Zahl der DNA-Doppelstränge.
| Zyklen $n$ | Idealisierte Anzahl $N$ |
|---|---|
| 0 | 1 |
| 1 | 2 |
| 2 | 4 |
| 3 | 8 |
| 10 | 1.024 |
| 30 | 1.073.741.824 |
Nach 30 Zyklen ergibt das Modell also etwa 1,07 Milliarden Moleküle aus einem Ausgangsmolekül.
$2^n$ ist ein Idealmodell, keine Garantie für die tatsächlich erhaltene Menge. Es setzt voraus, dass die Verdopplung in jedem Zyklus vollständig gelingt.
Wie wird ein PCR-Ergebnis nachgewiesen?
Viele Kopien allein sind noch keine sichtbare Auswertung. Das PCR-Produkt muss mit einem geeigneten Verfahren erfasst werden.
Bei der Agarose-Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente in einem Gel durch elektrische Spannung nach ihrer Länge getrennt. Kürzere Fragmente wandern schneller zum Pluspol als längere. Ein Bandenmuster zeigt daher, an welchen Positionen DNA-Fragmente bestimmter Länge liegen. Eine Bande beweist für sich allein noch nicht, dass die gesamte Probe oder ihre Herkunft eindeutig bestimmt ist.
Bei der qPCR wird die entstehende DNA während der Zyklen mithilfe eines Fluoreszenzsignals gemessen. Bei der RT-PCR wird RNA zunächst durch Reverse Transkriptase in komplementäre DNA, kurz cDNA, umgeschrieben; erst diese cDNA wird mit PCR vervielfältigt.
Kontrollen helfen, ein Signal einzuordnen:
- Eine Positivkontrolle enthält den Zielabschnitt und sollte ein Signal liefern. Bleibt es aus, kann die Reaktion fehlerhaft sein.
- Eine Negativkontrolle enthält keinen Zielabschnitt und sollte kein Signal liefern. Tritt dennoch eines auf, muss zum Beispiel eine Verunreinigung oder unspezifische Reaktion geprüft werden.
Eine Probe und die Positivkontrolle zeigen eine Bande in der erwarteten Länge; die Negativkontrolle zeigt keine Bande. Das Ergebnis spricht dafür, dass der Zielabschnitt in der Probe vervielfältigt wurde und die Kontrolle keine erkennbare Verunreinigung anzeigt. Es beantwortet aber nur die gestellte Nachweisfrage und ersetzt keine weitergehende Beurteilung der Probe.
Welche Anwendungen und Grenzen hat die PCR?
PCR wird eingesetzt, wenn ein bestimmter DNA-Abschnitt in einer kleinen Ausgangsmenge nachgewiesen oder für weitere Analysen vervielfältigt werden soll. Beispiele sind:
- Erregerdiagnostik und Untersuchung von Erbkrankheiten;
- Forensik und Verwandtschaftsanalysen;
- Evolutionsforschung;
- Vorbereitung von Sequenzierungen oder gentechnischen Arbeitsschritten.
Das Verfahren muss zur Frage passen. DNA kann direkt vervielfältigt werden. Soll RNA untersucht werden, ist zunächst die Umschreibung in cDNA nötig. Soll die Länge eines Produkts geprüft werden, eignet sich eine Gelelektrophorese; soll die Produktmenge während der Reaktion verfolgt werden, eignet sich qPCR.
Wichtige Grenzen sind:
- PCR vervielfältigt nur den durch die Primer ausgewählten Bereich, nicht automatisch die gesamte DNA.
- Der gezielte Primerentwurf setzt bekannte Binderegionen voraus.
- Ein Signal zeigt den nachgewiesenen Zielabschnitt unter den Versuchsbedingungen; seine Bedeutung hängt von Fragestellung, Kontrollen und Auswertung ab.
- Unerwünschte Fragmente können entstehen und müssen bei Bedarf nach ihrer Länge getrennt werden.
- Die Formel $2^n$ überschätzt die reale Ausbeute, sobald ein Zyklus nicht vollständig verdoppelt.
Karteikasten
Überlege zuerst selbst und drehe die Karte anschließend zum Prüfen um.
Alles auf einen Blick
- PCR
- Zweck
- ausgewählten DNA-Abschnitt vervielfältigen
- Bestandteile
- Vorlage, zwei Primer, Nukleotide, Taq-Polymerase
- Temperaturzyklus
- Denaturierung, Primerhybridisierung, Elongation
- Wachstum
- idealisiert $N = 2^n$
- Auswertung
- Gelelektrophorese oder qPCR mit Kontrollen
- Grenzen
- bekannte Binderegionen und fragengerechte Interpretation
- Zweck